[생물 임용 노트]DNA 복제 - 1) DNA 복제에 대한 가설 증명

반보존적 복제

양친의 DNA 이중나선이 두 가닥으로 분리되고 이 가닥들이 각각 새로 합성될 가닥의 주형으로 작용한다는 것.

Meselson  & Stahl의 증명 실험

6M의 CsCl 용액에서 평형 밀도 구배 원심 분리 시 밀도에 따라 띠가 형성된다.

(6M CsCl - 1.7g/㎤ , ¹⁴N DNA - 1.710g/㎤ , ¹⁵N DNA - 1.724g/㎤)

¹⁵N 배지에서 키운 세포를 ¹⁵N 제거 후 ¹⁴N 배지로 옮겨 배양한 후 DNA를 분리하여 원심분리한다. 이후 이 용액에 EtBr 처리 후 자외선 하에서 관찰한다. 이때 초나선 DNA는 밀도가 더 높게 관찰되는데, 이는 EtBr이 부유 밀도를 낮추기 때문이다.

 

<실험 결과>

제 1세대 - 모두 ¹⁴과 ¹⁵N의 중간 밀도의 DNA를 가졌다. - 보존적 복제 기작 기각

제 2세대 - DNA의 반은 중간 밀도, 나머지는 가벼운 밀도의 DNA를 가졌다. - 분산적 복제 기작 기각

불연속적 복제 - okazaki fragment

[³H] dT 함유 배지에 매우 짧은 시간 동안 T₄ 파지를 배양하여 DNA 복제 과정의 생성물에 방사능 동위원소 표지(pulse-labeling)를 한다. 이후 DNA 복제 과정에서 만들어진 DNA 생성물을 분리하여 크기에 따라 분리한다.

짧은 시간 동안 표지시 - 산물이 1000~2000nt가 대부분(짧은 절편)

긴 시간동안 표지시 - 산물이 긴 절편도 관찰

→ 펄스 표지 시간이 길 수록 긴 DNA 절편의 양이 증가한다.

→ DNA ligase 결핍 T₄ 돌연변이체에 같은 실험 시 대부분 짧은 DNA 절편만 생성한다.

 

즉, DNA 복제 과정 중 짧은 오카자키 절편이 존재하고 DNA ligase에 의해 연결된다는 의미이다.

오카자키 절편 합성과 관련한 실험 결과

 

(왼쪽 - DNA ligase가 정상인 경우) 2~15s 까지는 비교적 짧은 절편들이 만들어지나 30s부터는 선도가닥과 구분이 되면서 오카자키 절편이 만들어지는 것을 확인할 수 있다. 

(오른쪽 - DNA ligase가 비정상인 경우) 짧은 절편들 위주로만 합성되는 것을 볼 수 있다. 선도 가닥의 경우 합성 과정에서 DNA ligase가 사용되지 않기에 정상적으로 합성이 된다.

 

DNA 양방향 복제

AT-rich 변성 자리를 만들어 관찰 한 뒤 양방향성 복제를 확인하였다.

일방향성 복제, 양방향 복제 가설 증명. 검은 색은 원래 가닥, 파란색은 새로 합성되는 가닥이다.

 

복제 원점을 기준으로 A-T rich 부위를 변성시킨 후 합성을 했을 때 나타는 bubble의 개수가

3개인 경우 → 일방향성 복제

4개인 경우 → 양방향성 복제

라고 볼 수 있다.