[생물 임용 노트]단백질 정제와 정량 - 5) 단백질 서열 분석, 단백질 염색, 단백질 정량

단백질 서열 분석

Sanger 법

단백질에 FDNB를 처리하면 단백질의 N말단에 결합해 유도체를 형성이 가능하다. 여기에 6M HCl을 처리하면 아미노산이 유리되고 이 유리된 말단의 잔기를 동정하는 방식이다.
말단의 잔기만 동정이 가능하며, 단백질 구조에 말단의 수를 파악해 폴리펩타이드의 수를 확인하는 것이 가능하다.

**DNA 서열 분석 방법중에서 Sanger법이 존재한다.

Edman 분해법

단백질에 PTC 처리 후 CH3COOH 처리 시 아미노 말단이 제거되고 이 아미노산을 분석할 수 있다.
아미노산의 수가 20개 넘는 펩타이드는 효율이 낮으며, 작은 조각으로 분리 시 효율이 증가한다.

단백질 염색과 정량

염색

• 코마시 염색(Comassie-staining) : Arg, Lys과 결합하는 염색 물질을 사용한다. 단백질과 염색 물질이 결합 시 흡광도가 465nm에서 595nm로 변화한다.
• 은 염색(Silver-staining) : 은 이온이 음전하를 띄는 작용기와 결합하는 것을 이용한다. 민감도가 높다.

정량 - 브래드포드(Bradford) 정량

상대적으로 비단백질 성분(SDS, TritonX-100 등)에 의한 방해가 적은 장점이 있다. 염색약으로 코마시 블루를 이용하며 595nm에서의 흡광도가 단백질 농도와 비례한다.

 

과정

1. 농도를 아는 BSA(혈청 알부민, 1mg/ml)와 PBS buffer(pH 7.4)를 시험관에 넣고 잘 섞어 다양한 희석 배율로 표준 용액을 제조한다.
2. PBS를 이용해 분리 단백질을 시험관에 넣고 적당한 비율로 희석한다.
3. 표준 용액과 샘플 용액에 Bradford 시약을 1ml 넣고 10분간 반응시킨다.
4. 595nm에서 파장을 측정한다.
5. 표준 용액으로 곡선을 그린 후 농도를 계산한다.