[생물 임용 노트]단백질 정제와 정량 - 4) 웨스턴 블롯(western blot)

개요

SDS-PAGE로 분리된 단백질을 전기영동으로 분리시켜 니트로셀룰로스(nitrocellulose) 필터에 옮긴 후('blot'이라고 함), 방사성 동위원소나 효소, 형광 물질이 결합된 특정 항체를 이용하여 단백질을 확인하고 단백질의 크기와 양을 조사하는 방법이다. 민감도가 높은 실험 방법이다.

실험 과정

1. 전기영동이 끝난 gel과 필터(nylon, nitrocellulose, PVDF)를 겹친 후 전기영동 하여 gel에서 필터로 단백질을 이동 시킴
2. 1차 항체를 필터와 배양하여 섭씨 4도에서 오랜 시간동안 단백질과 1차 항체를 결합시킴
3. 계면활성제(Tween20)가 포함된 buffer로 씻어 냄
4. 1차 항체에 대한 항체(2차 항쳬)에 alkaline phophate 또는 HBP 같은 리포터 효소를 결합시켜 1차 항체에 결합시킴
5. 계면활성제가 포함된 Buffer로 다시 씻어냄
6. 필터에 기질을 첨가 후 발색 여부를 확인

알아두면 좋은 사항

1. 1차 항체는 배양온도가 높을 수록(섭씨 37도 정도) 빠르게 결합하지만 비특이적 결합율도 증가한다.
2. 배양 온도가 낮으면(섭씨 4도 정도) 느리게 결합하지만 비특이적 결합률은 감소한다.
3. 계면활성제, 무지방 우유 등으로 비특이적 결합을 제거하는 과정을 'blocking'이라고 한다.
4. 리포터 효소에 해당하는 기질의 예 : BICP - alkaline phophate / DAB - HBP