[생물 임용 노트]단백질 정제와 정량 - 2) 크로마토그래피(chromatography)

종이 크로마토그래피

개요

이동상(색소)이 전개액에 대한 용해도(친화력), 분자의 크기, 전개지에 대한 흡착력에 따라 전개율이 달라지는 것을 이용하는 방식이다.
용해도가 높아질수록, 분자의 크기가 작을수록, 흡착력이 낮을수록 전개율이 높다.

실험 과정 예시

1. 시금치잎에 석영과 모래를 넣고 으깬 뒤에 메탄올:아세톤 = 3:1 혼합용액에 넣고 색소를 추출한다.
2. 용지를 자르고 아래에서 2cm 지점에 원점을 표시한 후 시료를 점적한다.
3. 톨루엔을 매스 실린더 아래 2cm만 넣고 용지를 아래 1cm 잠기도록 장치한다.
4. 전개액이 종이 상단에 도달시 각 색소를 표시한다.
5. 전개율 = 원점에서 색소 까지의 거리 / 원점에서 용매전선 거리

종이 크로마토그래피 예시

관 크로마토그래피(column chromatography)

특이한 화학적 특징을 지닌 고정상을 이루는 물질을 관에 채워 수행하는 방식이다. 단백질의 크기, 전하, 친화력 및 다른 특징에 따라 분리할 수 있다.
단백질의 이동 속도는 고정상과 반응성 차이에 따라 달라지며, 용출속도가 이에 따라 달라진다. 관의 길이가 길수록 해상도가 증가한다.

이온 교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography)

사용하는 전하의 종류와 세기에 따라 분리하는 방식이다.

• 양이온 교환 크로마토그래피
  • 음전하를 띠는 작용기가 부착된 고정상(수지)
  • 양전하가 클수록(pI가 높을수록) 결합력이 높아 이동속도가 낮음
  • 음전하가 클수록(pI가 낮을수록) 결합력이 낮아 이동속도가 빠름
• 음이온 교환 크로마토그래피
  • 양전하를 띠는 작용기가 부착된 고정상(수지)
  • 음전하가 클수록(pI가 낮을수록) 결합력이 높아 이동속도가 낮음
  • 양전하가 클수록(pI가 높을수록) 결합력이 낮아 이동속도가 빠름
• 실험과정 예시
  1. column에 평형 완충용액을 첨가하여 수지와 평형을 이루게 한다.
  2. 단백질 시료를 첨가 한다.
  3. column의 3배 볼륨의 평형 완충용액을 첨가해 부적절한 결합을 제거한다.
  4. 해리 완충용액의 농도를 서서히 증가시키면서 단백질(고정상과 결합되어 있는)을 분리한다.
  5. 원하는 분획에서 단백질 농도를 측정한다.

크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)

• 특정 크기의 구멍을 갖는 다공성 gel(sephadex, shapharose)을 column에 채워 넣고, 고정상으로 이용하여 단백질을 크기에 따라 분리하는 방식이다.
• 크기가 작을수록 구멍 통과 횟수가 높아 저항이 높아져 이동속도가 낮아진다.
• 크기가 클수록 구멍 통과 횟수가 낮아 저항이 낮아져 이동속도가 높아진다.

친화도 크로마토그래피(affinity chromatography)

• 특정 화학기(리간드)가 공유결합에 의해 부착된 구슬을 column에 채워 고정상으로 이용하고, 단백질을 분리하는 방식이다.
• 리간드에 결합이 가능한 단백질은 이동속도가 느리고, 다른 단백질은 이동속도가 빨라 먼저 제거된다.
• 이후 유리 리간드를 이용하여 단백질을 용출시켜 분리한다.

고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)

• 고압 펌프를 이용해 단백질의 이동속도를 빠르게 하여 분리하기 때문에, 고압에 견딜 수 있는 물질을 이용한다.
• 단백질 띠의 확산을 억제하여 분해능을 증가시킬 수 있다.