[생물 임용 노트]단백질 정제와 정량 - 3) 전기영동

개요

• 전기영동은 하전 된 입자가 전기장에서 반대 전하의 전극 쪽으로 이동하는 원리를 이용하여 물질을 분리하는 것을 말한다.
• 방향은 전하의 종류에 따라 다르다.
• 이동속도는 전하의 세기, 입자 모양, 입자 크기에 따라 다르다.
• 고정상에 대한 저항의 정도에 따라 다르다.
• 고정상은 agargose gel 또는 polyacrylamide gel을 사용한다.
• 이동상은 시료이다.
• 이동에 대한 힘은 전압이다.

SDS-PAGE(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)

• 단백질을 음전하로 코팅하여 polyacrylamide gel에서 단백질 분자량에 따라 전기영동하는 방법이다. gel-polyacrylamide와 bis-polyacrylamide 등으로 구성되어 있으며, 서로 연결되어 구멍(pore)을 형성한다.
• 관찰하고자 하는 단백질의 분자량에 따라 gel의 농도를 달리한다. 분자량이 클수록 낮은 농도, 분자량이 작을수록 높은 농도를 사용한다.
• 분리되는 원리는 단백질과 gel 사이의 충돌에 의한 저항 차이를 이용한다. 분자량이 클수록 gel과 많이 충돌하여 속도가 낮아지고, 분자량이 작을수록 gel과 충돌이 적어 상대적으로 속도가 빠르다.
• 단백질의 구조적 차이를 없애기 위해 음전하를 띠는 SDS로 비공유 결합을 파괴한 뒤(단백질 변성), 환원제인 mercapto ethanol이나 DTT를 이용하여 이황화 결합을 파괴한다.
• SDS는 또한 2개의 아미노산 당 하나가 결합하여 큰 전하를 부여하여, 전하의 차이에 따라 이동속도 차이를 없애준다.

실험 과정

1. 기구 조립 후 running gel을 제작하여 gel을 굳힌다(약 8~20%).
2. 그 위에 stacking gel을 붓고 comb을 설치한다(~4%).
3. 단백질에 SDS gel-leading buffer를 처리한다.
4. 이 용액을 섭씨 100도로 5분간 가열 후 섭씨 4도에 보관하면서 전기영동을 실시한다.
5. marker와 같이 실시하여 대략적인 크기를 측정한다.
   stacking gel은 단백질 시료들이 동일 지점에서 출발이 가능하게 한다.

Isoelectric focusing

저분자량의 유기산과 염기 혼합물을 gel을 가로질러 생긴 전기장에 분배시켜 pH 기울기를 형성한 뒤, 단백질 혼합물을 전개하면 각 단백질이 그 pI와 일치하는 pH에 도달 시까지 이동한 후 pI와 일치하는 pH에 정지하는 것을 이용한 전기영동 방법이다.

isoelectric focusing 예시

2차원 전기영동(two-dimension electrophoresis)

• 두 번의 연속적인 전기영동을 실시한다. 예를 들어 1차는 전하에 따라, 2차는 크기에 따라 실시하는 방식이다.
• Isoelectric focusing과 SDS-PAGE를 결합해 실시할 수도 있다.

2차원 전기영동 예시