[생물 임용 노트]단백질 정제와 정량 - 1) 원심 분리

개요

원심력을 이용하여 세포 내 구성물을 크기와 밀도 및 용해도 정도에 따라 분리하는 것 → 분리 속도는 침강계수 또는 S로 나타낸다.

침강속도 영향을 미치는 요인

• 부력 : 침강에 저항하는 힘으로 밀도가 클수록 작다.
• 수용성 : 입자의 크기가 클수록 불용성 정도가 높다.
• 입자 모양 : 점성에 의한 저항력의 차이가 존재한다. 긴 모양이 구형보다 먼저 침전한다.
• 입자 질량 : 질량이 클 수록 더 빨리 침전한다.
• 입자 밀도 : 밀도가 클수록 빨리 침전한다.

 

종류

속도 침전(velocity sedimentation)

• 5~20% 설탕 용액을 사용하여 관의 아래로 갈수록 설탕 농도를 증가하게 만든 뒤, 시료를 용액 위에 중층 하여 원심력을 가하는 방식이다.
• 크기와 밀도가 다른 입자들이 서로 다른 영역에 띠를 이루면서 서로 다른 속도로 아래쪽으로 이동한다.
• 오랜 기간 원심력을 주면 모두 침전이 되어 버리므로 어느 정도 띠가 벌어질때 멈추는 것이 좋다.
• 리소좀, 퍼옥시좀, 미토콘드리아 등 그 밀도가 아주 약간씩 다른 것을 분리할때 사용한다.

평형 침전(equilibrium sedimentation)

• 세포 내 구성물 크기와 모양이 아닌 부유 밀도에 따라 원심 분리하는 방식이다.
• 고농도의 CsCl(염화 세슘)을 이용하여 급격한 밀도 구배를 형성하는 완충액을 사용한다.
• 높은 원심력으로 침전이 시작되며, 물질의 밀도가 완충액 밀도와 같은 곳에서 멈춘다.
• 서로 구분되는 층을 형성하여 분리된다.
• 미세한 차이를 보이는 물질(같은 분자라도 구성원자가 다른 경우)을 구분할 수 있다.

분획 원심분리

속도를 점차 증가시키면서 반복적으로 원심분리하는 방법으로, 균질액에서 세포의 구성성분을 분획화 할 수 있다.
구성 성분의 크기와 밀도 차이에 따라 분리할 수 있다. 크기와 밀도가 큰 것이 먼저 분리된다.

분획 원심분리 예시

 

침전물 1 : 세포, 핵, 세포골격, 세포막
침전물 2 : 미토콘드리아, 리소좀, 퍼옥시좀, 글라이옥시좀, 엽록체
침전물 3 : E.R. 파편, 작은 소낭
침전물 4 : 리보솜, 바이러스, 거대분자(단백질, RNA 등)