[생물 임용 노트]유전자 클로닝과 실험기법 - 3) 유전자 재조합, 유전자 도서관

전반적 과정

1. 대장균에서 플라스미드 추출
2. 목적 유전자를 가진 DNA를 제한 효소로 절단
3. 제한 효소로 절단된 플라스미드와 목적 유전자 절편을 DNA ligase로 재조합
4. 재조합 플라스미드를 대장균에 형질 전환
5. ampicilin과 X-gal이 첨가된 고체 배지에 배양
6. 재조합 플라스미드를 선별하여 액체배지에 대량으로 배양

플라스미드 분리

1. 플라스미드를 갖는 단일 클론 대장균 colony를 영양 배지에 20hr 배양
2. 배양액을 원심 분리한 후 대장균을 수확(침전물)
3. 대장균 용액에 solution1(glucose, EDTA, Tris-HCl pH8.0) 첨가
   • EDTA - Ca2+ 제거 + 세포벽 일부 파괴, glucose - 세포 용혈방지(삼투압 유지
4. solution2(0.2N NaOH, 1% SDS) 첨가
   • NaOH - 세포벽 파괴 및 DNA 변성
5. solution3(3M potassium acetate pH4.8) 첨가
   • potassium acetate - DNA 응축 및 침전(대장균 유전체만), pH4.8 - 중화 기능
6. 일정 시간이 지나고 원심 분리 후 상층액을 취함
   • 하층 - 대장균 염색체, 찌꺼기, 큰 입자
   • 상층 - plasmid DNA
7. isopropanol 첨가 - 플라스미드 응축 및 침전
8. 원심 분리 후 침전물을 취함
9. DNA를 70% 에탄올로 세척하여 염 같은 불순물을 제거 → 이후 RNaseH로 RNA 제거, phenol로 단백질 제거 가능
10. 상온에서 건조 후 완충 용액에 녹여 DNA 용액을 획득
11. DNA 농도와 순도를 측정
12. 일부 혼합된 대장균 DNA는 CsCl 초원심 분리를 통해 분리가 가능하다.

플라스미드 DNA와 목적 유전자 재조합

• 플라스미드 벡터와 목적 유전자 DNA를 제한효소로 절단한다.
• DNA ligase 활성을 갖는 완충용액에 두 DNA 절편과 DNA ligase를 첨가하여 재조합한다.

재조합 플라스미드 삽입

• CaCl₂ 처리 : 고농도 칼슘 용액은 플라스미드의 투과성을 높여서 재조합률을 높여준다.
• 전기 천공법(electroporation) : 짧은 전기 충격 시 순각적으로 세포막의 투과성이 증가한다.
• 42℃에서 1분간 열 충격
• RecA 균주 이용 - 대장균 유전체 내 삽입을 방지한다.

고체 배지를 통한 선별

약제 내성(pBR322)

• 플라스미드가 없는 군집 - 앰피실린 과 테트라사이클린에 모두 생존하지 못함
• 플라스미드는 있으나 재조합되지 않은 군집 - 앰피실린과 테트라사이클린 모두에서 생존
• 플라스미드가 있고, 재조합된 군집 - 앰피실린에서는 생존하지만, 테트라사이클린에서는 생존하지 못함

약제 내성과 색소 차이(pBluescriptⅢ)

• 테트라사이클린 대신 MCS를 포함하는 lacZ 유전자가 존재하는 개체이다.
• β-galactosidase를 가져 X-gal과 반응 시 푸른색 염색 물질을 생성한다.
• 조건에 따른 생존과 색 변화
  • 플라스미드가 없는 군집 - 앰피실린 내성이 없어 생존하지 못함
  • 플라스미드는 있으나 재조합되지 않은 군집 - β-galactosidase를 합성해 X-gal을 분해함 → 푸른색 군집 형성
  • 플라스미드가 있고, 재조합된 군집 - β-galactosidase를 합성하지 못해 X-gal을 분해 못 함 → 흰색 군집 형성

유전자 도서관(gene library)

제작

원하는 세포에서 핵의 DNA를 추출하고 DNA를 제한효소로 절단하여 절편을 획득한다. 이를 통해 재조합 플라스미드 제작 후, 형질 전환 시키고 대장균을 클로닝한다.

선별

DNA 혼성화 탐침(DNA hybridiztion probe)을 이용하여 선별한다.

• 배양 접시에 여과지를 통해 복제
• 용균시킨 후 알칼리 용액을 통해 DNA 변성
• 자기 방사법을 이용하여 탐침과 결합한 colony를 선별
• 선별 후 증식