[생물 임용 노트]유전자 클로닝과 실험기법 - 4) PCR과 cDNA 클로닝

PCR(polymerase chain reaction)

StepⅠ. DNA 변성

이중가닥 DNA를 94℃ ~ 98℃ 정도의 고온 처리하여 단일 가닥으로 변성시킨다.

• G-C 비율이 높을수록 온도를 높게 주고 시간을 길게 주어
• A-T 비율이 높을 수록 온도를 낮게 주고 시간을 짧게 주어

시료 DNA가 완전히 풀어지게 한다.

StepⅡ. 혼성화(annealing)

50℃ ~ 65℃로 낮추어 DNA primer가 변성가닥의 DNA와 혼성화하게 함

Tm 값을 적절히 유지하기 위해,

• primer 길이 길수록, 반응 온도를 높임
• GC 함량비가 높을수록, 반응 온도를 높임
• 반응온도가 높으면 혼성화율이 낮아지고, 반응온도가 낮으면 비특이적 결합률이 높아짐

StepⅢ. DNA 합성

호열성 세균에서 추출한 Taq polymerase로 DNA를 증폭한다.

72℃ 정도로 높은 온도를 유지한다.

** 증폭 산물의 확인 : 전기 영동 후 EtBr(Etidium bromide) 처리 시, 자외선 조사할 때 오렌지색 형광이 발생한다.

RT-PCR(reverse transcriptipase polymerase chain reaction)

RNA를 PCR 하는 방법 - DNA로 역전사 후 증폭하는 방법

• primer : 역전사 과정에 역전사 효소(reversen transcriptase)를 이용하여 상보적인 cDNA를 합성한다
  • 모든 mRNA의 cDNA 제작시 → oligo-dT primer 이용(poly A tail에 결합)
  • 목적 유전자 cDNA 제작시 → 유전자 특이적 primer 이용
  • 모든 RNA(rRNA, tRNA, mRNA) → Random 6mer primer 이용
• RNase H : RNA 주형으로부터 형성된 DNA-RNA 잡종 가닥의 RNA를 분해 → endonuclease, exonuclease 기능을 모두 가짐
• RT-PCR 각 단계의 온도 변화 : 초기 40~50℃ 온도에서 역전사 효소에 의해 역전사 후 94℃ 까지 올린 뒤 다음 단계는 동일

cDNA library의 제작

cDNA 도서관

mRNA를 주형으로 복사된 DNA 분자인 cDNA 전체의 모음

RNase H를 이용한 cDNA 도서관 제작

• 세포로부터 mRNA 추출한 후, oligo-dT 프라이머와 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 합성
• RNase H를 이용하여 mRNA를 부분적으로 분해, 이 과정에서 남아 있는 RNA가 primer로 작용
• 대장균 DNA polⅠ을 통해 cDNA 가닥을 완성(5'-end 제외하고 모두 DNA 상태)
• 말단 전달 효소(TdT)를 이용하여 이중가닥 cDNA 말단에 oligo-dC를 첨가한다.
• 위 같은 방법으로 oligo G가 첨가된 cDNA와 같이 넣고 DNA ligase를 처리한다.
• 만들어진 재조합 플라스미드가 대장균에서 형질 전환 후 RNA 부분은 DNA polⅠ에 의해 제거
• 유전자 재조합 실험으로 cDNA 도서관 제작

자가프라이밍(self-priming) 이용한 cDNA 제작

• mRNA oligo-dT와 dNTPs, 역전사 효소와 반응하여 cDNA 가닥 합성
• cDNA와 mRNA 혼성체 고온 처리하여 변성시키고, 알칼리 용액에서 mRNA 가수분해
• 역전사 효소에 의해 단일가닥 cDNA 말단에 hairpin loop 형성 - primer 역할
• 5'→3' exonuclease 활성이 제거된 DNA polymeraseⅠ(klenow fragment)을 처리하여 이중가닥 형성
• S1 nuclease로 hairpin 구조 제거 → 벡터에 재조합하여 클로닝

** cDNA 이용 : 원핵생물 유전자 발현 시스템을 이용하여 진핵생물 유전자 발현 산물을 얻기 위해서 이용 가능(인트론이 제거된 상태이기 때문)