[생물 임용 노트]유전자 클로닝과 실험기법 - 5) 클로닝된 유전자의 발현

발현 벡터를 이용한 발현

puc 플라스미드 이용

puc 벡터는 lac 프로모터 뒤에 존재하는 lacZ 유전자에 MCS가 존재한다. 이 MCS에 목적 유전자가 삽입된다. 이 유전자 N말단에 lacZ gene의 일부가 포함된다.

강력한 프로모터

trp 프로모터를 이용하여 많은 양의 mRNA를 생성하는 것이 가능하다. trp 프로모터를 갖고 operator와 SD 서열을 갖고 있어 외부 유전자 재조합 시 삽입 유전자는 직접 발현되어 단백질을 생성한다.

유도성 발현

lac 프로모터를 가지는 벡터이다. lac 억제 인자에 의해 저해되고 있으며, 유도물질 IPTG에 의해 발현된다.

융합 단백질 생산과 분리

MCS 바로 앞에 6개의 His를 암호화하는 pTrc His 벡터의 경우, N-말단에 6개의 His를 갖는 융합 단백질을 생성한다. 이는 Ni 수지를 이용한 친화성 크로마토그래피를 이용하여 분리하는 것이 가능하다. 또한 enterokinase에 의해 절단하여 원하는 부위를 얻을 수 있다.

invitro 전사와 번역

세포 내의 RNA 전사, 번역에 필요한 요소만 분리하여 test tube 안에 특정 유전자를 발현 시키는 것이다.

진핵 세포에서의 발현

진핵세포 유전자의 대장균 내에서 발현시의 문제점

• 대장균 내에서 발현 사눔ㄹ의 분해가 일어날 수 있음
• 번역 후 변형 과정이 일어나지 않아 활성도가 낮아진다. → 당화가 일어나지 않음
• 대장균 내에서 전확히 접히지 못함

클로닝 유전자의 문제점 해결

• shuttle vector 이용 : 대장균에서 클로닝 후, 진핵세포에서 유전자를 발현시킨다.
• baculo virus 이용 : 강력한 프로모터(폴리헤드린)를 가져서 그 뒤에 유전자 삽입 후 벡터를 만들고 곤충 세포에 형질을 주입한다.

동물 세포에 형질 주입율을 높이는 법

1. 세포를 인산염과 칼슘 DNA와 혼합 - Ca₃(PO₄)₂가 DNA의 세포 내 유입을 돕는다.
2. liposome에 DNA를 주입 후 동물 세포와 융합한다.

Ti 플라스미드와 형질 전환

아그로 박테리아

• Ti 플라스미드 : 식물에서 종양을 만드는 유전자들이 모여 있는 곳
  • vir 영역(virulence gene) : T-DNA 좌우편의 25bp의 염기 서열을 인식 후 절단하고, T-DNA를 식물 DNA에 삽입시켜 형질 전환하는 산물을 암호화한다.
  • T-DNA : 대략 20kb 크기의 DNA 영역, opine, ipt, 옥신 합성 관여 유전자를 가짐
• 식물에서 종양 형성 과정 : 상처 시 상처 부위에 감염 → 식물 상처 부위의 분비 물질이 Ti 플라스미드의 vir 발현을 유도 → vir 단백질이 T-DNA를 Ti 플라스미드에서 분리하여 식물 DNA에 삽입 → 형질 전환 식물세포에서 T-DNA에 의해 opine, 사이토키닌, 옥신을 대량으로 합성 → opine은 영양원으로, 사이토키닌과 옥신은 종양을 형성함

형질 전환 식물 제작

Ti 플라스미드를 추출한 후 제한효소를 처리하여 ipt 옥신 유전자를 제거하고 목적 유전자를 삽입 → 아그로박테리아에 형질 전환 → 식물세포에 cellulase와 pectinase를 처리하여 원형질체를 만들고 아그로 박테리아를 이용하여 형질전환 → opine을 선별자로 이용하여 형질전환 세포를 선별 → 세포에서 옥신과 사이토키닌을 동시에 처리하여 미분화 세포 덩어리인 캘러스를 형성 → 옥신을 처리하여 뿌리 분화 → 사이토키닌을 처리하여 줄기 분화 → 유식물체를 배양하여 형질 전환 식물을 만듦