[생물 임용 노트]유전자 클로닝과 실험기법 - 6) 분자 생물학적 실험 방법 : Southern blot, Nothern blot, DNA microarray, in situ hybridization, chrIP

핵산의 혼성화를 이용한 분자 생물학적 실험 방법이다. 탐침(probe)이나 핵산과 특이적으로 결합하는 단백질 등을 이용한다.

Soluther blot

DNA 시료에 특정 DNA 염기서열의 유무를 확인

• 과정
  1. 제한 효소로 시료 절단
  2. agarose gel에 DNA 절편들을 전기 영동하여 크기별로 분리
  3. gel에 NaOH를 첨가하여 이중가닥 DNA를 단일 가닥으로 변성
  4. 적당한 완충용액으로 단일가닥 DNA를 필터로 옮김
  5. 필터에 고온, UV 처리를 하여 공유 결합 시킴
  6. 시료 DNA를 탐침과 혼성화시켜 특정 DNA 서열을 가지는 표적 DNA 확인
  7. 탐침은 방사능, 형광, 발색으로 표지
  8. 과량으로 붙은 탐침을 제거하고 확인

Nothern blot

• RNA 발현량의 차이나 RNA 존재 유무를 확인하는 방법
• Southern blot과 비슷하나, RNA 2차 구조 형성을 막기 위해 포름알데하이드를 gel에 첨가함

DNA microarray

유리판이나 적절한 지지대 위에 이미 알고 있는 짧은 DNA 분자를 결합시켜 수 천 개에 달하는 유전자의 발현 양상을 관찰하는 방법이다.
세포 생리를 조절하는 복잡한 유전자의 발현이나 특수 조건에 대한 유전자 발현 유무를 관찰한다.

• 과정
  1. 유전자 특이 DNA 절편 수집
  2. PCR로 증폭
  3. 산물을 지지대에 고정
  4. 분석하고자 하는 mRNA를 추출하여 역전사 cDNA 탐침 제작
     • 예시> 하나는 적색(A세포), 하는 녹색(B세포)
  5. 마이크로어레이와 혼성화
  6. 형광을 보고 분석
     • A만 발현시 붉은색
     • B만 발현시 녹색
     • 둘 다 발현시 노란색

in situ hybridization

표지 된 탐침을 염색체나 세포질의 mRNA와 직접 혼성화 시키는 것이다.
특정 유전자 지역 찾기, 유전자가 활발히 발현되는 지역을 증명할 수 있다.

• 과정
  1. 슬라이드에 배아나 조직을 고정
  2. 계면 활성제와 protease K를 처리하여 조직을 연하게 하고, 불필요한 단백질을 분해하여 탐침이 내부로 들어오게 함
  3. DTG로 표지된 표적 mRNA에 상보적인 탐침을 처리
  4. Alkaline phosphatase가 부착된 항 DTG 항체를 처리
  5. BICP를 처리하여 발색 위치를 확인

chromatin immuno precipitation(chrIP)

genome과 연결된 단백질 혹은 특정 단백질과 연결된 genome의 위치를 확인한다.

• 과정
  1. 포름알데하이드나 UV를 처리하여 단백질과 DNA를 가역적으로 교차 결합 시킴
  2. 세포에서 염색질 분리
  3. 초음파로 DNA 절단
  4. 표적 DNA-단백질 복합체를 면역 침전
  5. 항체에 비드나, 마그네틱 비드를 이용하여 복합체 정제
  6. DNA 분리 시킴
  7. PCR 후 분석