[생물 임용 노트]유전자 클로닝과 실험기법 - 6) 분자 생물학적 실험 방법 : 핵산의 분리와 정량, FRET, Quantitative RT-PCR, yeast two-hybrid analysis, 핵형 분석

핵산의 분리와 정량

RNA 분리

1. 조직이나 배양 세포를 파괴
2. RNA 분리용액을 넣고 원심분리를 실시
   • RNA 분리 용액 : phenol, guanidine thiocyanate, chloroform 혼합액
3. 원심 분리 용액이 3개의 층으로 구분되는데, 이때 상층액을 취함
   • 상층 - RNA, 중층 - DNA, 하층 - 단백질
4. isopropanol을 첨가하여 원심 분리해 RNA를 침전 시킴
5. 침전물을 취하여 70% 에탄올로 처리 후 건조
6. 완충용액에 녹인 후 RNA 정량

RNA 정량

• 260nm에 측정한 흡광도를 'A₂₆₀' 이라고 함.
• A₂₆₀의 값이 1일 때의 밀도는 dsDNA = 50ug/ml, ssDNA = 33ug/ml, RNA = 40ug/ml이다.
• RNA의 농도 = 밀도 x A₂₆₀ x 희석 배율(ug/ml)
• RNA의 양 = 농도 x 시료의 양(ug)

DNA 분리

1. SDS, protease K 같은 용액을 같이 사용해 조직이나 배양세포 파괴
2. DNA 분리 용액을 첨가 후 원심 분리
   • DNA 분리 용액 : phenol:chloroform:isoamylalcohol = 25:24:1 혼합액
3. 상층액을 취하여 100% 에탄올과 아세트산 나트륨을 첨가
4. 원심분리하여 침전물을 취함(DNA 존재)
5. 70% 에탄올로 DNA 침전물 세척
6. 에탄올 제거 후 건조한 뒤, 완충액에 녹임
7. RNA 제거를 위해 RNase A 처리 후 반복

FRET(형광 공명 에너지 전달)

주개(형광물질)과 받개(Quencher) 사이의 에너지 전달 현상으로 주개와 받개가 근접 시 양 물질 사이에서 형광 공명 에너지 전달이 일어난다. 이때 주개의 에너지는 기저 상태로, 받개의 에너지는 흥분 상태가 되어 형광 신호가 검출된다. 단, 거리가 10-100Å로 근접해야 한다.

• 적용 : Cy3, Cy5 같은 시아닌 염료는 550nm 보다 큰 파장을 방출한다.
  • Cy3 : 550nm 흡수, 590nm 방출
  • Cy5 : 590nm 흡수, 680nm 방출
  • 만일 Cy3와 Cy5가 근접시 540nm의 빛을 흡수 후 590nm의 빛을 방출, 이 에너지를 Cy5가 흡수 후 680nm의 빛을 방출한다.

Quantitative RT-PCR(real-time PCR)

DNA 증폭과 동시에 정량적으로 분석하는 것이 가능하다. PCR 반응을 위해 형광 표지 탐침이 이용된다.
PCR의 annealing 단계에서 탐침이 붙어 있다가 중합 단계에서 DNA pol에 의해 형광 물질((R))이 떨어져 나가서 형광을 방출하게 된다. 형광이 매 cycle마다 증가한다.

reporter probe(형광 표지 탐침)

효모 이중 융합 분석(yeast two-hybrid analysis)

유전자 활성화 단백질은 기본적으로 DNA binding domain과 gene activation domain이 있다. 하나는 염기서열과 결합하고, 다른 하나는 RNA pol의 전사를 촉진하는 역할을 한다. → 두 영역의 단백질을 이용하여 목적 단백질에 결합되는 단백질을 확인하는 것이 가능하다.

핵형 분석

PHA : 백혈구를 백혈구 아세포로 탈분화시키고, 세포 분열을 촉진한다.
콜히친 : 세포 후기로 진행을 억제한다. 중기 세포의 비율이 높아진다.
저장액 : 적혈구를 용혈시켜 제거하고, 백혈구를 최대 팽창 시켜 염색체 관찰을 용이하게 한다.
혼합액 : 세포 고정의 역할을 수행한다.

핵형 분석 과정