[생물 임용 노트]유전자 클로닝과 실험기법 - 6) 분자 생물학적 실험 방법 : 리포터 유전자, 형질 전환 생쥐, 유전자 적중법, RNAi

유전자의 기능을 확인하기 위한 실험 방법들이다.

리포터 유전자

조사하려는 유전자 조절 부위를 리포터 유전자 앞에 붙여서 발현 정도를 분석하는 것이 가능하다.

리포터 유전자 예시

형질전환 생쥐 이용

배아 줄기세포(ES cell)를 이용하여 만든다.

• 과정
  1. 배아 공여자 생쥐에서 줄기세포 분리
  2. 배양 보조세포(feeder cell)를 첨가하여 배양
  3. vector를 이용하여 목적 유전자를 형질 전환
  4. 형질 전환 줄기세포를 새로운 배반포에 주입
  5. 대리모 자궁에 착상
  6. 키메라 생쥐 탄생
  7. 야생형 생쥐와 교배 후 이형접합 생쥐 생성
  8. 이형접합 개체 끼리 교배하여 동형접합 개체 선별

유전자 적중(파괴)법

상동 재조합을 이용하여 정산 유전자를 돌연변이 유전자와 교체시켜 유전자 발현을 억제하는 것을 이용하는 방법이다.

• 과정
  1. 표적 유전자 vector에 네오마이신 저항성 유전자를 재조합시켜 돌연변이 vector를 제작
     • ihimidinkinase 이용 시 acyclovir, ganciclovir 존재 배지에서 하며, 이들 존재 시 DNA 복제가 억제되는 것을 이용한 선별 과정을 거친다.
  2. ES cell에 전기 천공법으로 형질 전환
  3. 네오마이신 저항성으로 선별
  4. ES cell을 배반포에 주입 후 대리모에 착상
  5. 이형접합 쥐 생산
  6. 이형접합 개체끼리 교배시켜 유전자 적정 쥐 생산
  7. 표적 유전자 기능 분석

RNA 간섭(RNAi, RNA interference)

세포에 전사된 mRNA 가닥에 상보적인 단일가닥 RNA인 antisense RNA 주입 시 정상 mRNA와 이중 결합을 형성하며 mRNA가 파괴된다.

RNAi의 2가지 과정(왼쪽: miRNA 경로, 오른쪽: siRNA 경로)

miRNA 경로

1. 1차 mi-RNA 전사체를 암호화하는 좌위를 RNA pol이 전사하여 pre-miRNA 형성
2. pre-miRNA는 hairpin 구조를 형성함
3. DICER-LIKE1(DCL1) 단백질에 의해 21~24NT의 단일가닥으로 분해되어 miRNA로 전환
4. miRNA가 RISC와 복합체를 형성 **여기까지는 핵에서 일어나는 과정
5. EXPORTIN5에 의해 세포질로 이동
6. 번역 억제, mRNA 분해

siRNA 경로

miRNA 경로와 비슷하다. 하지만 mRNA 주형 가닥 외에 상보가닥도 동시에 전사되어 형성되거나, RNA 의존성 RNA pol에 의해 이중가닥을 형성한다.