[생물 임용 노트]유전자 클로닝과 실험기법 - 6) 분자 생물학적 실험 방법 : 표지 추적, DNA 염기서열 분석

표지 추적

자기 방사법(autoradiography)

• 동위 원소 표지 DNA 절편을 전기영동
• 한 장의 X선 필름 gel과 접촉시켜 수 시간 ~ 수 일 방치하여 β-선에 감광 시킴
• 필름 현상 후 분석

비방사성 추적자

• biotin으로 표지된 dNTP로 탐침 DNA를 복제
• 탐침 DNA를 변성 시킨 후 표적 DNA와 혼성화
• 아비딘(일종의 alkaline phophate)을 첨가하여 biotin에 결합 시킴
• 인산기 기질을 첨가하여 발광 시킴
• X선 필름을 통한 자기 방사나 인 영상기를 통해 탐지

DNA 염기 서열 분석 방법

Sanger 사슬 종결법

3'-OH에서 산소가 제거된 ddNTP를 다량의 dNTP와 같이 넣고 DNA 중합 시 우연히 들어간 ddNTP에 의해 합성이 조기 종결되는 원리를 이용한다.

• 과정
  1. 분석 DNA 이중가닥을 변성
  2. DNA 프라이머(방사성 표지)를 단일 가닥 DNA와 혼성화
  3. 다량의 dNTP, 한 종류의 ddNTP를 넣고 DNA 중합(A, T, G, C 총 4번)
  4. 4가지 DNA 용액을 동일 gel에 전기영동
  5. 자기 방사법으로 염기서열을 분석

Sanger 사슬 종결법 전기영동 결과 예시

위에서 합성 가닥은 3'-ATTGACTCGAC-5' 이며,

분석하고자 하는 주형 가닥의 서열은 합성 가닥의 상보적 서열인 5'-TAACTGAGCTG-3' 이다.

Maxam-Gilbert 서열 분석법

DNA를 화학적으로 처리하여 AP site를 만든 후 그 부위를 읽는 법이다.

• 과정
  1. 특이적 절단을 수행
     • G 특이적 절단 - 방사능 표지된 DNA에 DMS 처리 후 피페리딘 처리
     • 퓨린 특이적 절단 - 산 처리 후 피페리딘 처리
     • C 특이적 절단 - 하이드라진 포함 1M NaCl 처리 후 피페리딘 처리
     • 피리미딘 특이적 절단 - 하이드라진 처리 후 피페리딘 처리
  2. AP site를 인식하여 5'-end를 자르는 DNase를 처리
  3. 같은 gel상에 전기영동
  4. 자기 방사법으로 판독하여 염기 서열을 정한다.
     • G와 퓨린에서 모두 절단 시 G
     • 퓨린에서만 절단되어 보이는 것은 A
     • C와 피리미딘 모두 절단시 C
     • 피리미딘에서만 보이는 것은 T