숭늉의 연구일지

핵산의 혼성화를 이용한 분자 생물학적 실험 방법이다. 탐침(probe)이나 핵산과 특이적으로 결합하는 단백질 등을 이용한다.Soluther blotDNA 시료에 특정 DNA 염기서열의 유무를 확인과정제한 효소로 시료 절단agarose gel에 DNA 절편들을 전기 영동하여 크기별로 분리gel에 NaOH를 첨가하여 이중가닥 DNA를 단일 가닥으로 변성적당한 완충용액으로 단일가닥 DNA를 필터로 옮김필터에 고온, UV 처리를 하여 공유 결합 시킴시료 DNA를 탐침과 혼성화시켜 특정 DNA 서열을 가지는 표적 DNA 확인탐침은 방사능, 형광, 발색으로 표지과량으로 붙은 탐침을 제거하고 확인Nothern blotRNA 발현량의 차이나 RNA 존재 유무를 확인하는 방법Southern blot과 비슷하나, RNA ..

표지 추적자기 방사법(autoradiography)동위 원소 표지 DNA 절편을 전기영동한 장의 X선 필름 gel과 접촉시켜 수 시간 ~ 수 일 방치하여 β-선에 감광 시킴필름 현상 후 분석비방사성 추적자biotin으로 표지된 dNTP로 탐침 DNA를 복제탐침 DNA를 변성 시킨 후 표적 DNA와 혼성화아비딘(일종의 alkaline phophate)을 첨가하여 biotin에 결합 시킴인산기 기질을 첨가하여 발광 시킴X선 필름을 통한 자기 방사나 인 영상기를 통해 탐지DNA 염기 서열 분석 방법Sanger 사슬 종결법3'-OH에서 산소가 제거된 ddNTP를 다량의 dNTP와 같이 넣고 DNA 중합 시 우연히 들어간 ddNTP에 의해 합성이 조기 종결되는 원리를 이용한다.과정분석 DNA 이중가닥을 변성DNA..

발현 벡터를 이용한 발현puc 플라스미드 이용puc 벡터는 lac 프로모터 뒤에 존재하는 lacZ 유전자에 MCS가 존재한다. 이 MCS에 목적 유전자가 삽입된다. 이 유전자 N말단에 lacZ gene의 일부가 포함된다.강력한 프로모터trp 프로모터를 이용하여 많은 양의 mRNA를 생성하는 것이 가능하다. trp 프로모터를 갖고 operator와 SD 서열을 갖고 있어 외부 유전자 재조합 시 삽입 유전자는 직접 발현되어 단백질을 생성한다.유도성 발현lac 프로모터를 가지는 벡터이다. lac 억제 인자에 의해 저해되고 있으며, 유도물질 IPTG에 의해 발현된다.융합 단백질 생산과 분리MCS 바로 앞에 6개의 His를 암호화하는 pTrc His 벡터의 경우, N-말단에 6개의 His를 갖는 융합 단백질을 생..

PCR(polymerase chain reaction)StepⅠ. DNA 변성이중가닥 DNA를 94℃ ~ 98℃ 정도의 고온 처리하여 단일 가닥으로 변성시킨다.G-C 비율이 높을수록 온도를 높게 주고 시간을 길게 주어A-T 비율이 높을 수록 온도를 낮게 주고 시간을 짧게 주어시료 DNA가 완전히 풀어지게 한다. StepⅡ. 혼성화(annealing)50℃ ~ 65℃로 낮추어 DNA primer가 변성가닥의 DNA와 혼성화하게 함Tm 값을 적절히 유지하기 위해,primer 길이 길수록, 반응 온도를 높임GC 함량비가 높을수록, 반응 온도를 높임반응온도가 높으면 혼성화율이 낮아지고, 반응온도가 낮으면 비특이적 결합률이 높아짐StepⅢ. DNA 합성호열성 세균에서 추출한 Taq polymerase로 DNA를 ..

전반적 과정대장균에서 플라스미드 추출목적 유전자를 가진 DNA를 제한 효소로 절단제한 효소로 절단된 플라스미드와 목적 유전자 절편을 DNA ligase로 재조합재조합 플라스미드를 대장균에 형질 전환ampicilin과 X-gal이 첨가된 고체 배지에 배양재조합 플라스미드를 선별하여 액체배지에 대량으로 배양플라스미드 분리플라스미드를 갖는 단일 클론 대장균 colony를 영양 배지에 20hr 배양배양액을 원심 분리한 후 대장균을 수확(침전물)대장균 용액에 solution1(glucose, EDTA, Tris-HCl pH8.0) 첨가EDTA - Ca2+ 제거 + 세포벽 일부 파괴, glucose - 세포 용혈방지(삼투압 유지solution2(0.2N NaOH, 1% SDS) 첨가NaOH - 세포벽 파괴 및 DN..

벡터(vector)유전 물질을 전달하기 위해 전달 매개체로 사용되는 DNA 분자를 의미한다.클로닝 벡터는 DNA 클로닝을 목적으로 하는 벡터, 유전자 발현 벡터는 유전자를 발현시키는 것을 목적으로 하는 벡터이다.벡터의 조건cloning vector복제 원점을 가져야 한다.특정 유전자 재조합과 DNA 형질 전환 여부를 확인 가능한 선별 지표가 필요하다.숙주에 쉽게 들어가야한다.형질 전환이 쉽게 일어나야 한다.클로닝에 유리한 제한 효소 절단 부위가 존재해야 한다. → 하나 이상의 제한 자리 존재함.MCS(multiple cloning site) : 여러 개의 제한 자리의 밀집 지역을 의미한다.유전자 발현 벡터강력한 프로모터를 가져야 한다. 예> 대장균의 trp 프로모터효율적인 전사와 번역이 일어나야 한다.벡..

제한효소(restrict enzyme)특정 핵산 염기 서열만 인식하여 절단하는 endonuclease를 의미한다.제한 자리(restriction site) : DNA 제한효소가 인식하는 DNA의 특정 염기 서열이다. 회문 구조를 이루고 있으며, 염기 서열이 길수록 더 특이적으로 DNA를 절단하는 것이 가능하다.제한 효소에 의한 절편의 특징점착성 말단(sticky end) : 제한 자리를 엇갈리게 절단하여 상보적인 단일 가닥을 갖게 된다. 동일 효소로 자른 각 말단은 서로 상보적이어서 수소 결합을 통한 염기쌍 형성이 가능하다.평활 말단(blunt end) : 단일 가닥 꼬리를 갖지 않는 이중가닥 DNA 말단이다. DNA ligase에 의해 연결될 확률은 낮지만 제한 효소 종류에 관계없이 평활 말단끼리 연결..

단백질 서열 분석Sanger 법단백질에 FDNB를 처리하면 단백질의 N말단에 결합해 유도체를 형성이 가능하다. 여기에 6M HCl을 처리하면 아미노산이 유리되고 이 유리된 말단의 잔기를 동정하는 방식이다.말단의 잔기만 동정이 가능하며, 단백질 구조에 말단의 수를 파악해 폴리펩타이드의 수를 확인하는 것이 가능하다.**DNA 서열 분석 방법중에서 Sanger법이 존재한다.Edman 분해법단백질에 PTC 처리 후 CH3COOH 처리 시 아미노 말단이 제거되고 이 아미노산을 분석할 수 있다.아미노산의 수가 20개 넘는 펩타이드는 효율이 낮으며, 작은 조각으로 분리 시 효율이 증가한다.단백질 염색과 정량염색코마시 염색(Comassie-staining) : Arg, Lys과 결합하는 염색 물질을 사용한다. 단백질과..