숭늉의 연구일지

전반적 과정대장균에서 플라스미드 추출목적 유전자를 가진 DNA를 제한 효소로 절단제한 효소로 절단된 플라스미드와 목적 유전자 절편을 DNA ligase로 재조합재조합 플라스미드를 대장균에 형질 전환ampicilin과 X-gal이 첨가된 고체 배지에 배양재조합 플라스미드를 선별하여 액체배지에 대량으로 배양플라스미드 분리플라스미드를 갖는 단일 클론 대장균 colony를 영양 배지에 20hr 배양배양액을 원심 분리한 후 대장균을 수확(침전물)대장균 용액에 solution1(glucose, EDTA, Tris-HCl pH8.0) 첨가EDTA - Ca2+ 제거 + 세포벽 일부 파괴, glucose - 세포 용혈방지(삼투압 유지solution2(0.2N NaOH, 1% SDS) 첨가NaOH - 세포벽 파괴 및 DN..

벡터(vector)유전 물질을 전달하기 위해 전달 매개체로 사용되는 DNA 분자를 의미한다.클로닝 벡터는 DNA 클로닝을 목적으로 하는 벡터, 유전자 발현 벡터는 유전자를 발현시키는 것을 목적으로 하는 벡터이다.벡터의 조건cloning vector복제 원점을 가져야 한다.특정 유전자 재조합과 DNA 형질 전환 여부를 확인 가능한 선별 지표가 필요하다.숙주에 쉽게 들어가야한다.형질 전환이 쉽게 일어나야 한다.클로닝에 유리한 제한 효소 절단 부위가 존재해야 한다. → 하나 이상의 제한 자리 존재함.MCS(multiple cloning site) : 여러 개의 제한 자리의 밀집 지역을 의미한다.유전자 발현 벡터강력한 프로모터를 가져야 한다. 예> 대장균의 trp 프로모터효율적인 전사와 번역이 일어나야 한다.벡..

제한효소(restrict enzyme)특정 핵산 염기 서열만 인식하여 절단하는 endonuclease를 의미한다.제한 자리(restriction site) : DNA 제한효소가 인식하는 DNA의 특정 염기 서열이다. 회문 구조를 이루고 있으며, 염기 서열이 길수록 더 특이적으로 DNA를 절단하는 것이 가능하다.제한 효소에 의한 절편의 특징점착성 말단(sticky end) : 제한 자리를 엇갈리게 절단하여 상보적인 단일 가닥을 갖게 된다. 동일 효소로 자른 각 말단은 서로 상보적이어서 수소 결합을 통한 염기쌍 형성이 가능하다.평활 말단(blunt end) : 단일 가닥 꼬리를 갖지 않는 이중가닥 DNA 말단이다. DNA ligase에 의해 연결될 확률은 낮지만 제한 효소 종류에 관계없이 평활 말단끼리 연결..

단백질 서열 분석Sanger 법단백질에 FDNB를 처리하면 단백질의 N말단에 결합해 유도체를 형성이 가능하다. 여기에 6M HCl을 처리하면 아미노산이 유리되고 이 유리된 말단의 잔기를 동정하는 방식이다.말단의 잔기만 동정이 가능하며, 단백질 구조에 말단의 수를 파악해 폴리펩타이드의 수를 확인하는 것이 가능하다.**DNA 서열 분석 방법중에서 Sanger법이 존재한다.Edman 분해법단백질에 PTC 처리 후 CH3COOH 처리 시 아미노 말단이 제거되고 이 아미노산을 분석할 수 있다.아미노산의 수가 20개 넘는 펩타이드는 효율이 낮으며, 작은 조각으로 분리 시 효율이 증가한다.단백질 염색과 정량염색코마시 염색(Comassie-staining) : Arg, Lys과 결합하는 염색 물질을 사용한다. 단백질과..

단백질 시료를 빠르게 확인하고 정량화하는 방법 중 하나이다.실험 방법96-well 폴리스티렌 플레이트의 비활성 표면에 단백질 시료 부착 후 세척비점유 자리에 케이신을 채움검출하고자 하는 단백질에 대한 항체를 항온 처리세척 후 2차 항체 처리기질 첨가 후 발색시켜 강도를 측정하여 정량화샌드위치 ELISA결합 순서가 1차 항체 - 단백질 - 2차 항체(단백질에 대한) - 효소가 결합된 3차 항체 - 기질 첨가 순으로 하여 발색시킨 후 흡광도를 측정하는 방식이다.면역 측정법(immunoassay)항원을 항체가 결합된 라텍스에 처리해 항원-항체 반응을 일으켜 응집물을 형성 시켜 이들을 육안으로 확인할 수 있게 하는 방법이다.대표적인 예시> 임신 키트; 오줌 속의 HCG를 항 HCG로 검출하는 방법

개요SDS-PAGE로 분리된 단백질을 전기영동으로 분리시켜 니트로셀룰로스(nitrocellulose) 필터에 옮긴 후('blot'이라고 함), 방사성 동위원소나 효소, 형광 물질이 결합된 특정 항체를 이용하여 단백질을 확인하고 단백질의 크기와 양을 조사하는 방법이다. 민감도가 높은 실험 방법이다.실험 과정전기영동이 끝난 gel과 필터(nylon, nitrocellulose, PVDF)를 겹친 후 전기영동 하여 gel에서 필터로 단백질을 이동 시킴1차 항체를 필터와 배양하여 섭씨 4도에서 오랜 시간동안 단백질과 1차 항체를 결합시킴계면활성제(Tween20)가 포함된 buffer로 씻어 냄1차 항체에 대한 항체(2차 항쳬)에 alkaline phophate 또는 HBP 같은 리포터 효소를 결합시켜 1차 항체..

개요전기영동은 하전 된 입자가 전기장에서 반대 전하의 전극 쪽으로 이동하는 원리를 이용하여 물질을 분리하는 것을 말한다.방향은 전하의 종류에 따라 다르다.이동속도는 전하의 세기, 입자 모양, 입자 크기에 따라 다르다.고정상에 대한 저항의 정도에 따라 다르다.고정상은 agargose gel 또는 polyacrylamide gel을 사용한다.이동상은 시료이다.이동에 대한 힘은 전압이다.SDS-PAGE(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)단백질을 음전하로 코팅하여 polyacrylamide gel에서 단백질 분자량에 따라 전기영동하는 방법이다. gel-polyacrylamide와 bis-polyacrylamide 등으로 구성되어 있으며, 서로 연결되어 구멍(pore)을 형성한..

종이 크로마토그래피개요이동상(색소)이 전개액에 대한 용해도(친화력), 분자의 크기, 전개지에 대한 흡착력에 따라 전개율이 달라지는 것을 이용하는 방식이다.용해도가 높아질수록, 분자의 크기가 작을수록, 흡착력이 낮을수록 전개율이 높다.실험 과정 예시시금치잎에 석영과 모래를 넣고 으깬 뒤에 메탄올:아세톤 = 3:1 혼합용액에 넣고 색소를 추출한다.용지를 자르고 아래에서 2cm 지점에 원점을 표시한 후 시료를 점적한다.톨루엔을 매스 실린더 아래 2cm만 넣고 용지를 아래 1cm 잠기도록 장치한다.전개액이 종이 상단에 도달시 각 색소를 표시한다.전개율 = 원점에서 색소 까지의 거리 / 원점에서 용매전선 거리관 크로마토그래피(column chromatography)특이한 화학적 특징을 지닌 고정상을 이루는 물질을..